Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

Ở phần I, nói tổng quan về nuôi cấy mô thực vật là gì, tiếp theo phần II nói về các thành phần trong môi trường nuôi cấy. Trong phần III, sẽ giới thiệu các kỹ thuật nuôi cấy mô thường được dùng.

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

SƠ LƯỢC CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

NUÔI CẤY PHÔI

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom.
Raghavan ( 1976, 7980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng ( tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên.

NUÔI CẤY MÔ VÀ CƠ QUAN TÁCH RỜI

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn,…). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, …) và các chất điều hoà sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp các chất này.

NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,…

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.

NUÔI CẤY BAO PHẤN

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa.Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX. Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.

NUÔI CẤY PROTOPLAST

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là người đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.