Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a

Ở phần trước, “Nuôi cấy mô thực vật và môi trường nuôi cấy phần II” có giới thiệu các thành phần dinh dưỡng cụ thế bổ sung . Ở phần II-a sẽ tiếp tục nói về các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao gồm các amino acid, than hoạt tính, nước dừa bột chuối, dịch nấm men..

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô

a. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sang cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adenine. Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05-0,1%. Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Một ví dụ về amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự tăng trưởng của tế bào là glysine 2 mg/l, glutamine đến 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine và cysteine 10 mg/l và L-tyrosine 100 mg/l. Tyrosine cũng được sử dụng để kích thích sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên sử dụng trong môi trường có agar. Cung cấp adenine sulfate vào môi trường nuôi cấy có thể kích sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy và kích thích mạnh sự tạo chồi.
Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau. Mặc dù thế, việc bổ sung các amino acid vào môi trường vẫn cần thiết để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế bào. Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế bào thực vật hấp thụ nhanh hơn. Casein hydrolysate (0,05-0,1%), L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine (100 mmol/L), L glycine (2 mmol/L), L-arginine và L-cystein (10 mmol/L) là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy. Tyrosine (100 mmol/L) chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường. Các amino acid được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn. Bổ sung vào môi trường adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo chồi.

b. Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đên môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy.

Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v). Bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà chua. Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, đậu tương và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung AC được rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng độ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy. AC cũng giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì.

c. Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).

d. Bột chuối

Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy mô một số cây trồng như phong lan. Hàm lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/l. Để tránh đóng cục, cần bổ sung bột vào dung dịch một cách từ từ rồi

khuấy đều. Nước chiết từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh cũng được sử dụng bổ sung vào môi trường.

Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp khác

Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ

phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.

A. Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)

Với dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng.

B. Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)

Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid.

C. Hỗn hợp amino acid nhân tạo

Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp amino acid nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng. Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau, có thể do yêu cầu amino acid của từng loại tế bào là không giống nhau. Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng. i. Agar Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu ôxy. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar; một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%.